Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel dieses Forschungsvorhabens war die Entwicklung und verfahrenstechnische Beschreibung eines umweltfreundlichen Bioverfahrens zur Gewinnung von Carotinoiden mit In-situ-Produktisolierung am Beispiel eines industrierelevanten Mikroorganismus. Der Neuheitswert lag dabei in der m\u00f6glich gewordenen Direktisolierung des hydrophoben Zielproduktes im Produktionsprozess, wobei der Mikroorganismus nicht besch\u00e4digt wird und sukzessiv die Zielprodukte im Kulturmedium weiter bildet. Mit der Entwicklung und Etablierung des Verfahrens soll durch Nutzung von Nebenstoffstr\u00f6men der Lebensmittel- und Pflanzen\u00f6lindustrie, Minimierung des Wasser- und Platzbedarfes und die Direktisolierung des Zielproduktes ein signifikanter Beitrag zur Ern\u00e4hrungssicherung, Erweiterung der Kreislaufwirtschaft und nachhaltigen Schonung nat\u00fcrlicher Ressourcen geleistet werden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenZur Entwicklung und sp\u00e4teren Ma\u00dfstabs\u00fcbertragung des neuartigen Bioprozesses wurden zun\u00e4chst verschiedene Hefen und Pilze auf ihre Carotinoidbildung und Ausschleusungsf\u00e4higkeit im Sch\u00fcttelkol-benma\u00dfstab untersucht. Die f\u00fcr die Carotinoidbildung ben\u00f6tigte N\u00e4hrstofflimitation wurde in Mehrfach-bestimmungen unter Nutzung eines bereitstehenden Ionenchromatographen (Anionen und Kationen) sowie durch HPLC-Untersuchungen (Carotinoide) ermittelt. Im Folgenenden wurde das Substratspekt-rum des ausgew\u00e4hlten Organismus untersucht. Dazu wurden Untersuchungen mit Mono- und Misch-substraten ausgef\u00fchrt und die Kohlenstoffquelle mit den h\u00f6chsten Produktausbeuten und extrazellul\u00e4-ren Carotinoidkonzentration ermittelt. Inwieweit das eingesetzte lipophile Extraktionsmittel Anionen und Kationen aus der w\u00e4ssrigen Phase aufnimmt, wurde anschlie\u00dfend in mehreren Versuchsans\u00e4tzen un-tersucht.
\nDarauf Folgend erfolgte die Optimierung des Gehaltes der anorganischen Medienkomponenten sowie Untersuchungen zur Substitution von komplexen Medienbestandteilen. Durch Variation von ausgew\u00e4hl-ten Anionen, Kationen und Vitaminen wurde ein m\u00f6glicher Einfluss auf den Membrandiffusionsvorgang gepr\u00fcft. Das Verh\u00e4ltnis von Extraktionsmittel zur w\u00e4ssrigen Phase wurde durch Variation des Extrakti-onsmittelvolumens ermittelt. Anschlie\u00dfend wurden die verfahrenstechnischen Bedingungen f\u00fcr eine Ma\u00dfstabs\u00fcbertragung in den Bioreaktorma\u00dfstab festgelegt und zur Optimierung des Bioprozesses die optimale Bedingungen (Temperatur, pH-Wert, Begasungsrate, Zeitpunkt der Zugabe des Extraktions-mittels, Leistungseintrag) ermittelt. Abschlie\u00dfend wurde das Verh\u00e4ltnis zwischen intrazellul\u00e4rer Lipid-Konzentration und Carotinoid<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Bei der Findung eines geeigneten Mikroorganismus zur Carotinoid-Produktion und extrazellul\u00e4ren Produktisolierung gekoppelt mit paralleler intrazellul\u00e4rer Produktneusynthese kristallisierten sich die Blakeslea trispora Halbst\u00e4mme heraus. Die Resultate aus den Limitationsversuchen zeigen auf, dass die B. trispora Mischkultur aufgrund ihres hohen Carotinoid-Anteils, ihres hohen ?-Carotin-Anteils und des einfachen Handlings gegen\u00fcber den anderen Kandidaten f\u00fcr die Produktion von Carotinoiden als Vorzugsvariante am geeignetsten waren.
\nL\u00f6sliche St\u00e4rke wurde als geeignete Kohlenstoffquelle f\u00fcr die Produktion von Carotinoiden gefunden. Parallel dazu stellten sich Sonnenblumen\u00f6l und Biodiesel (Gemisch FAME) als effektive Extraktionsmittel f\u00fcr die extrazellul\u00e4re Gewinnung des Zielproduktes heraus. Das Mischsubstrat l\u00f6sliche St\u00e4rke\/Sonnenblumen\u00f6l wurde als effektive Kohlenstoffquelle detektiert. Konzentrationsgradienten von Anionen und Kationen, welche zwischen der w\u00e4ssrigen Phase und des nativen Extraktionsmittels auftreten k\u00f6nnten, wurden nicht beobachtet. In Mehrfachversuchen konnte gezeigt werden, dass durch die Aufhebung der N\u00e4hrstofflimitation (Stickstoff, Phosphat) sowohl der intrazellul\u00e4re Carotinoid-Massenanteil stieg als auch die Carotinoid-Konzentration in der Extraktionsphase um ein mehrfaches zunahm. Ein signifikanter Einfluss von Natrium, Chlor, Sulfat, Kalium und Magnesium auf die Produktbildung wurde nicht festgestellt. Dennoch ist das Vorhandensein dieser Salze f\u00fcr die Aktivierung und Stabilisierung des Stoffwechselgeschehens in Blakeslea trispora essentiell.
\nUntersuchungen zur Substitution von komplexen Medienbestandteilen wurden durchgef\u00fchrt. Sowohl in diesem Vorhaben als auch in diversen Untersuchungen anderer Forschungsgruppen konnte bisher f\u00fcr die Halbst\u00e4mme von B. trispora kein vollst\u00e4ndiges synthetisches Kulturmedium f\u00fcr ein optimales Wachstum und eine bestm\u00f6gliche Produktsynthese entwickelt werden. Die Testung von alternativen Substraten aus der Biodieselherstellung (Glycerol, Rohglycerol, Glycerinwasser) wurde durchgef\u00fchrt. Sowohl das Pilzwachstum als auch die Produktsynthese waren gegen\u00fcber anderen C-Quellen wie Glucose oder l\u00f6sliche St\u00e4rke signifikant geringer, sodass der Einsatz mit Sekund\u00e4rstoffstr\u00f6men aus der Biodieselerzeugung nicht weiter verfolgt wurde.
\nZur Ermittlung der apparativen und verfahrenstechnischen Bedingungen wurden ein Multifors-R\u00fchrreaktorsystem (Infors) und ein Blasens\u00e4ulensystem von BBI-Biotech herangezogen. Aufgrund von Biomasseakkumulierungen an den Glasw\u00e4nden, um den R\u00fchrer sowie an den Sonden (pH, pO2) konnten keine repr\u00e4sentativen Untersuchungen im 1 L Multifors-System vorgenommen werden. Es zeigte sich vielmehr, dass mit dem Blasens\u00e4ulensystem eine intensive Durchmischung aller Phasen mit geringen spezifischen Leistungseintrag erreichbar war.
\nZur Ermittlung eines optimalen pH-Wertes f\u00fcr die Produktsynthese wurden Start-pH-Werte definiert und mittels NaOH oder H2SO4 statiert. Die Resultate zeigten, dass sowohl das Wachstum als auch die Produktsynthese in einem pH-Wert-Bereich von 5,6 bis 5,8 am effektivsten waren. Bei der zuk\u00fcnftigen Ma\u00dfstabs\u00fcbertragung in den Produktionsma\u00dfstab ist w\u00e4hrend des Kultivierungsvorganges kein pH-Shift notwendig. Die f\u00fcr das Pilzwachstum optimale Temperatur war 28 \u00b0C. Dem hingegen lag die Temperatur zur optimalen Produktsynthese zwischen 22 \u00b0C und 16 \u00b0C. Wobei bei 16 \u00b0C geringere Biomasseakkumulierung sowie ein feineres Myzel\/Pellet im System vorlag. Weiterhin wurde eine h\u00f6here Carotinoid-Konzentration im Extraktionsmittel bei 16 \u00b0C detektiert, welches auf die bessere Biomasseverteilung und somit gr\u00f6\u00dfere Stoffaustauschfl\u00e4che der Pilzbiomasse zur\u00fcckzuf\u00fchren ist. Ein f\u00fcr das 1 L Blasens\u00e4ulensystem optimaler spez. Leistungseintrag (3,14 W m-3) und die ausschlaggebende Begasungsrate (2 vvm) zur optimalen Produktsynthese und Produktausschleusung wurden ermittelt. F\u00fcr eine hohe extrazellul\u00e4re Carotinoid-Konzentration im Extraktionsmittel war die Zugabe des nativen Extraktionsmittels vom Beginn der Kultivierung an notwendig. Durch das Extraktionsmittel wurde die Pilzbiomasse st\u00e4rker im System verteilt und es kam zu geringeren Biomasseakkumulierung im Blasens\u00e4ulensystem.
\nDurch Zentrifugation konnten alle Phasen (w\u00e4ssrige Phase, Biomassephase, Extraktionsphase) ohne weitere kosten- oder zeitaufwendige Ma\u00dfnahmen aufgetrennt werden, sodass f\u00fcr die Produktaufarbeitung im gr\u00f6\u00dferen Ma\u00dfstab keine weiteren Verbindlichkeiten entstehen.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Auf Grundlage der neuen Forschungsresultate wurde eine Patentschrift mit dem Titel \u0084VERFAHREN ZUR GEWINNUNG EINES STOFFWECHSELPRODUKTES AUS PILZZELLEN\u0093 vom UFZ angemeldet (EP20214921.7). Nach der Offenlegung der Patentschrift soll eine Ver\u00f6ffentlichung der Ergebnisse in Fachjournals erfolgen.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die Entwicklung und Ma\u00dfstabs\u00fcbertragung eines neuartigen Bioverfahrens f\u00fcr Carotinoide mit In-situ-Produktisolierung wurde vom Sch\u00fcttelkolbenma\u00dfstab in einem Blasens\u00e4ulensystem erfolgreich vorge-nommen. Optimale Bedingungen, welche hohe intrazellul\u00e4re Carotinoid-Ausbeuten sowie hohe Caro-tinoid-Konzentrationen in der lipophilen Phase erlauben, wurden gefunden. Die Annahme der Aus-schleusung des Zielproduktes an die Extraktionsphase sowie die parallele intrazellul\u00e4re Produktneusyn-these konnte in umfangreichen Untersuchungen best\u00e4tigt werden. Hinsichtlich der Produktausbeuten m\u00fcssen weitere Untersuchungen mit Hochleistungsst\u00e4mmen vorgenommen werden. Carotinoid-Kristalle konnten im extrazellul\u00e4ren Raum nicht detektier werden, welches auf die geringe Leistungsf\u00e4-higkeit der Blakeslea-Wildtyphalbst\u00e4mme zur\u00fcckzuf\u00fchren ist. Untersuchungen zur vollst\u00e4ndigen Ent-fernung der Extraktionsphase, sodass eine reine Carotinoid-Kristallfraktion vorliegt, muss zuk\u00fcnftig vorgenommen werden. Das Verfahren bringt neben h\u00f6heren Raum-Zeit-Ausbeuten im Vergleich zu her-k\u00f6mmlichen Produktionsverfahren eine Verringerung der notwendigen Nutzung von erd\u00f6lbasierenden L\u00f6sungsmitteln mit sich.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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