Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Die Selektion auf nat\u00fcrlich vorkommende Resistenzen der Bienen gegen\u00fcber der Varroamilbe erscheint zur Zeit die einzige Alternative die Varroatose zu bek\u00e4mpfen und eine R\u00fcckstandsbildung in Bienenprodukten zu vermeiden. Unser Projekt hat sich zum Ziel gesetzt die Resistenzz\u00fcchtung mit Hilfe von modernen molekularbiologischen Methoden zu verbessern. Dabei werden diagnostische Expressionsmuster f\u00fcr das Hygieneverhalten identifiziert, die ein direktes Merkmal f\u00fcr die Z\u00fcchtung werden. Dieser Ansatz umgeht zum einen die limitierenden Zuchteigenschaften der Honigbiene und erleichtert zum anderen die Quantifizierung schwer messbarer Resistenzmerkmale.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenBienenv\u00f6lker wurden anhand quantifizierbarer hygienischer Merkmale (Ausr\u00e4umverhalten besch\u00e4digter Brut, Anzahl besch\u00e4digter bzw. gefallener Milben und Zuchtdaten) aus dem ganzen Bundesgebiet f\u00fcr die Z\u00fcchtung ausgew\u00e4hlt, um eine breite genetische Basis f\u00fcr die Experimente zu haben. Es wurden zun\u00e4chst Kreuzungen etabliert, die Genotypen von Bienen mit hohem und niedrigem Resistenzpotential in einer Kolonie miteinander vereinen.
\n Das hygienische Verhalten der Arbeitsbienen von sechs verschiedenen genetischen Herk\u00fcnften zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Bienenjahr wurde mit Hilfe einer Videokamera unter Infrarotlicht dokumentiert. Insgesamt wurde das hygienische Verhalten von \u00fcber 10.000 altersstandardisierten Bienen individuell untersucht. Bienen mit hygienischen Verhaltensweisen wurden identifiziert und der molekularen Analyse zugef\u00fchrt.
\n Um den Einfluss der genotypischen Zusammensetzung der sozialen Gruppe auf die Auspr\u00e4gung des individuellen Verhaltens zu untersuchen, wurden Gruppen mit unterschiedlichen Anteilen von Bienen der Genotypen mit hohem Resistenzpotential (H) und niedrigem Resistenzpotnetial (N) zusammengesetzt und das individuelle Verhalten von \u00fcber 7000 Bienen in verschiedenen unabh\u00e4ngigen Experimenten analysiert.
\n Die Genexpressionsmuster der hygienischen und nicht-hygienischen Bienen wurde mit Hilfe von zwei verschiedenen Typen von Microarray-Chips analysiert, die einerseits auf der Basis von EST-Sequenzen, andererseits auf der Basis der Honigbienen-Genomsequenz (ca. 13.000 Gene) entwickelt
\nwurden. Verglichen wurden 200 hygienische und 380 nicht-hygienische Bienen aus sechs Herk\u00fcnften und vier Zeitpunkten im Bienenjahr. Variablen im experimentellen Design waren neben dem Verhaltensmuster die unterschiedlichen genetischen Herk\u00fcnfte und der Zeitpunkt im Bienenjahr. Auf diese Weise entstanden insgesamt 58 Arrays. Anhand dieses Designs der Microarray-Studie konnten verhaltensabh\u00e4ngige Genexpressionen dargestellt werden, die unabh\u00e4ngig von Einfl\u00fcssen des Bienenjahrs und den verschiedenen genetischen Herk\u00fcnften sind. Bei einigen biologischen Replikaten wurde die cy3-\/cy5-Markierung der Proben vertauscht, um Varianzen infolge unterschiedlicher Bindungsaffinit\u00e4t der Fluoreszenzmarker zu ber\u00fccksichtigen. Die Intensit\u00e4ten der Hybridisierungssignale wurden mit Hilfe eines Scanners bestimmt, validiert und normalisiert. Die Basis der Varianzanalyse war der Logarithmus der normalisierten Intensit\u00e4tsratios (log ratio), wobei ein parametrischer Test unter Annahme ungleicher Varianzen durchgef\u00fchrt wurde (1-Weg-Analyse, Welch ANOVA). In der hierarchischen Clusteranalyse wurde die \u00c4hnlichkeit der Expressionsratios (Hygienisch\/Nicht-hygienisch) mit der \u00c4hnlichkeit der biologischen Proben kombiniert (2-Weg-Clusteranalyse). Analysen zur Vorhersage des Verhaltensmusters wurden auf Basis der Expressionsratios mit einer unterschiedlichen Anzahl an Vorhersagegenen und unterschiedlichen Subsets von Genen durchgef\u00fchrt (K-Nearest Neighbors, Genauswahlmethode Fishers Exact Test).<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Die Bienenkolonien, die V\u00e4ter mit hohem Resistenzpotential haben brachten signifikant mehr hygienische Bienen hervor als Bienenkolonien, die V\u00e4ter mit niedrigem Resistenzpotential haben. Der Ph\u00e4notyp der Vaterherkunft hat einen direkten Einflu\u00df auf die Nachkommenschaft und unterstreicht die direkte Vererbbarkeit des Hygieneverhaltens. Das Verhalten tritt jedoch nur in wenigen Individuen auf.
\n Die Zusammensetzung einer Bienenkolonie aus hygienischen und nicht-hygienischen Herk\u00fcnften hat Einflu\u00df auf die Auspr\u00e4gung des individuellen Hygieneverhaltens. Die Zahl hygienischer Bienen aus nicht-hygienischen Herk\u00fcnften erh\u00f6hte sich, wenn ein kleiner Anteil hygienischer Bienen vorhanden war. Umgekehrt erh\u00f6hte sich die Anzahl der hygienischen Bienen aus hygienischen Herk\u00fcnften nicht, wenn ein Gro\u00dfteil der Bienen aus nicht-hygienischen Herk\u00fcnften entstammt. Es ist also von Bedeutung, in welcher sozialen Umgebung das Zuchtmerkmal Hygienepotential bestimmt wird. F\u00fcr den Einsatz von diagnostischen genetischen Markern bedeutet dies, dass nur Kolonien mit hohem Verwandtschaftsgrad verwendet werden k\u00f6nnen, da nur in diesen Kolonien der Genotyp-Beitrag des Individuums unabh\u00e4ngig von der Gruppe gemessen werden kann, da die Individuen der Gruppe genotypisch sehr \u00e4hnlich sind. Bei der nat\u00fcrlichen Paarung wird die K\u00f6nigin von ca. 20 unverwandten Drohnen begattet, was Kolonien entstehen l\u00e4sst, die genotypisch sehr divers sind.
\n Wir konnten mit Hilfe von 58 Arrays 1777 Gene identifizieren die auf einem Signifikanzniveau von P < 0,05 unterschiedlich zwischen hygienischen und nicht-hygienischen Bienen exprimiert waren. Diese hygienespezifischen Expressionsmuster sind unabh\u00e4ngig von Herkunft und Zeitpunkt. Selbst auf einem Signifikanzniveau von P < 10-10 sind noch 42 Gene nachweisbar die besonders eindeutig mit dem Verhalten assoziiert sind. Unsere kreuzvalidierten Klassenvorhersagen zeigen, dass die Verhaltenskategorien bereits durch wenige Gene vorhergesagt werden k\u00f6nnen. Wir haben die Analyse mit 1777 Genen (P < 0,05) und mit 42 Genen (P < 10-10) durchgef\u00fchrt und konnten zeigen, dass 5 bis 10 Gene ausreichend sind, um hygienisches und nicht-hygienisches Verhalten sicher vorherzusagen. Aus der hochsignifikanten Gruppe der 42 Gene sind 5 Gene ausreichend, um das Verhalten zu 100 Prozent richtig vorherzusagen. Diese Befunde zeigen, dass zur Diagnose des Hygieneverhaltens die Analyse weniger vorhersagekr\u00e4ftiger Gene ausreichend ist, was eine wichtige Grundlage f\u00fcr die Entwicklung eines diagnostischen Markersystems ist. Die Mehrzahl der verhaltenskorrelierten Gene sind in hygienischen Bienen tendenziell hochreguliert, w\u00e4hrend 40% der Gene im Vergleich zu nicht-hygienischen Bienen niedriger exprimiert sind. Die meisten Gene (16-20%) fallen in die Gruppe der Stoffwechsel-Gene. Die zweith\u00e4ufigsten Kategorien bilden Gene des Transport- und Lokalisationsprozesses in der Zelle und Regulatorgene (Genexpression und Signaltransduktion). Dies zeigt, dass physiologsiche Prozesse eine unerwartet wichtige Rolle in der Auspr\u00e4gung des Verhaltens spielen, wobei Signaltransduktionskaskaden eine nicht unerhebliche Rolle spielen. Unterrepr\u00e4sentiert sind Gene, die mit neuronaler bzw. sensorischer Regulation assoziiert sind (1-7%). Zwei Gene, GB18956 und GB19916, haben ein besonders gutes Vorhersagepotential, sind hochsignifikant (P < 10-10) verhaltenskorreliert und haben sehr vielf\u00e4ltige biologische Funktionen, worunter so erfolgversprechende Kategorien fallen wie sensorische Rezeption und Verhaltensinteraktion.\n\n\n\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation\n\nDie Ergebnisse und das Konzept wurden bei den Tagungen der Deutschen Bieneninstitute 2005, 2006 und 2007 pr\u00e4sentiert. Die nun vollst\u00e4ndig analysierten Daten werden im n\u00e4chsten Jahr auf der Tagung der Bieneninstitute und weiteren Fachkonferenzen vorgestellt. Die Ergebnisse sollen in peer reviewed Zeitschriften publiziert werden. Berichte in den Imkerzeitschriften sollen folgen. Bew\u00e4hrt sich unser Markersystem in der imkerlichen Praxis, so werden wir unser System in einer Pressekonferenz vorstellen.\n\n\nFazit\n\nAus den von uns erzielten Ergebnissen lassen sich einige wichtige Erkenntnisse f\u00fcr die Z\u00fcchtung auf hygienische Bienen und damit auf eine varroatolerante Biene ableiten: (1) Eine geringe Anzahl von Genen (im Prinzip zehn bis f\u00fcnf Gene) sind ausreichend um das Verhalten vorherzusagen; (2) hygienisches Verhalten hat m\u00f6glicherweise eine generelle physiologische Ursache, wie aus dem gro\u00dfen Anteil identifizierter metabolischer Gene sichtbar wird; (3) die Zusammensetzung der Kolonie aus hygienischen und nicht-hygienischen Herk\u00fcnften hat einen gro\u00dfen Einfluss auf die Auspr\u00e4gung des individuellen hygienischen Verhaltens. Die Z\u00fcchtung muss die diverse genotypische Zusammensetzung des Bienenvolkes bei einer Zuchtwertsch\u00e4tzung f\u00fcr Varroatoleranz mehr ber\u00fccksichtigen. Die Anwendung eines Markersystems erscheint besonders dann lohnend, wenn der Verwandtschaftsgrad in der Kolonie gro\u00df ist. Dies w\u00fcrde die Genotypinteraktion Individuum\/Gruppe minimieren und das Expressionsprofil einem bestimmten Genotyp zuweisen helfen. Wir sind davon \u00fcberzeugt, dass mit einem solchen Ansatz die k\u00fcnftige Zuchtwertsch\u00e4tzung in der imkerlichen Praxis erheblich vereinfacht wird.\n<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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