Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel dieses Projekts ist die Entwicklung eines elektrochemischen Transplantations-Biochips, mit dem die immunsuppressive Aktivit\u00e4t der drei am h\u00e4ufigsten verwendeten Immunsuppressiva – Cyclosporin A, FK506 und Rapamycin – und ihrer Metabolite durch Ausbildung des in-vitro Wirkkomplexes (Immunophilin \/ Immunsuppressivum \/ Calcineurin bzw. mTOR) bestimmt werden soll. Die M\u00f6glichkeit der Bestimmung der immunsuppressiven Aktivit\u00e4t im Gegensatz zur reinen Konzentrationsbestimmung soll die Aussagekraft dieses Rezeptorassays im Vergleich zu den etablierten Analysenmethoden erheblich verbessern und die Steuerung der medikament\u00f6sen Therapie nach einer Transplantation vereinfachen. Diese innovative Analysenmethode soll in den Kliniken die g\u00e4ngige HPLC-Methode ersetzen, was zu einer deutlichen Verminderung von Umwelt- und Gesundheitsbelastungen f\u00fchrt. Dar\u00fcber hinaus soll diese einfach zu handhabende Analysenmethode auch in Arztpraxen bzw. zur Selbstkontrolle beim Patienten Anwendung finden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDa der Transplantations-Biochip u. a. im Rahmen der Patientenselbstkontrolle zum Einsatz kommen soll, muss er preisg\u00fcnstig herzustellen sein. Dieses l\u00e4sst sich mit Hilfe der Siebdrucktechnik realisieren. Auf dem Biochip soll der in-vitro Wirkkomplex nachgebildet werden, wobei die Detektion mittels einer mediatorvermittelten Enzymreaktion unter chronoamperometrischen Bedingungen erfolgen soll. Von daher sollen die Immunophiline mit einem Enzym markiert werden. Dieses wird durch die Herstellung eines Immunophilin-Streptavidin-Fusionsproteins mit anschlie\u00dfender Kopplung eines biotinylierten Enzyms realisiert. Somit finden verschiedene molekularbiologische Arbeitsschritte sowie die Proteinchemie ihren Einsatz. Parallel zur Entwicklung der Rezeptorassays auf dem Biochip ist der Rezeptorassay f\u00fcr FK506 auf der Biacore-Oberfl\u00e4che aufgebaut worden. Im Falle dieses optischen Biosensors ist die Markierung von Biomolek\u00fclen nicht notwendig, die Ausbildung des tern\u00e4ren Komplexes kann online verfolgt werden. Um eine Validierung der neuartigen Rezeptorassays f\u00fcr FK506 sowie f\u00fcr Rapamycin durchf\u00fchren zu k\u00f6nnen (f\u00fcr CsA steht sie zur Verf\u00fcgung), wurde eine HPLC-MS-Methode inkl. Probenvorbereitung mit-tels Festphasenextraktion f\u00fcr diese beiden Immunsuppressiva entwickelt bzw. optimiert. Ebenso wurde eine Probenvorbereitung f\u00fcr das Vermessen der Immunsuppressiva mit dem Biochip entwickelt, die ohne organische L\u00f6sungsmittel auskommt.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Der tern\u00e4re Wirkkomplex, bestehend aus FKBP \/ FK506 \/ Calcineurin (Cn) konnte erfolgreich auf der Biacore-Sensoroberfl\u00e4che aufgebaut werden. Es zeigte sich, dass der Wirkkomplex FKBP \/ FK506 \/ Cn stabiler ist als der Wirkkomplex Cyp \/ CsA \/ Calcineurin. Es wurde f\u00fcr die Bindung des bin\u00e4ren FKBP \/ FK506-Komplexes an Cn ein KD-Wert von 72 nM und ein koff-Wert von 2,43 x 10-3 s-1 ermittelt; f\u00fcr CsA liegen die Werte bei KD = 177 nM sowie koff = 1,91 x 10-2 s-1. Besonders der um den Faktor 10 kleinerer koff-Wert liefert den entscheidenden Beitrag f\u00fcr die gr\u00f6\u00dfere Stabilit\u00e4t des FKBP \/ FK506 \/ Cn-Komplexes. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Tatsache, dass die notwendige Konzentration an FK506 in der Phase der Erhaltungstherapie ca. um den Faktor 15 niedriger ist als die Konzentration des CsA. Die rekombinanten Fusionsproteine aus Immunophilin und Streptavidin (Strept) – Cyclophilin-Streptavidin (Cyp-Strept) sowie FKBP-Streptavidin (FKBP-Strept) – sind erfolgreich kloniert und exprimiert worden. Zwecks besserer Aufreinigung wurden alle rekombinanten Proteine mit einem His-Taq versehen. F\u00fcr die Herstellung der Immunophilin-Enzym-Konjugate wurde folgende Strategie umgesetzt: (I) Herstellung eines re-kombinanten Immunophilin \/ Strept-Fusionsproteins und (II) Kombination des rekombinanten Fusionsproteins mit biotinylierter Peroxidase (POD) zum fertigen Immunophilin-POD-Konjugat. Durch diese Strategie wird sichergestellt, dass die Immunophiline reproduzierbar modifiziert werden k\u00f6nnen. Pro 1-Liter Kultur wurden 1,19 mg Strept-FKBP-POD-Biotin sowie 0,56 mg Strept-Cyp-POD-Biotin erhalten. Beide Immunophilin-POD-Konjugate zeigen eine cis-trans-Isomeraseaktivit\u00e4t. Weiterhin konnte mit Hilfe eines Hemmtests gezeigt werden, dass beide Immunophiline (Cyp, FKBP) eine Bindungsaffinit\u00e4t zum jeweiligen Immunsuppressivum (CsA, FK506) aufweisen. Mit Hilfe der Biacore-Methode konnte gezeigt werden, dass die Immunophilin-Konjugate nur in Gegenwart des entsprechenden Immunsuppressivums an Cn binden. Somit beeintr\u00e4chtigen die angekoppelten Proteine nicht die Ausbildung des tern\u00e4ren Wirkkomplexes. Im Falle des elektrochemischen Biochips mit aufgebrachter Microfilling Technik wurde f\u00fcr das Modellsystem – Avidin\/biotinylierter Antik\u00f6rper\/anti-IgG-POD – eine Sensitivit\u00e4t von 0,53 nA\/(ng\/ml) und eine Nachweisgrenze von 9,45 ng\/ml erreicht. Der Nachweis der Immunsuppressiva CsA und FK506 erfolgte mit der Top-Fill Variante des Biochips. Auf der Sensoroberfl\u00e4che wurde Cn immobilisiert. Zur Bestimmung von CsA bzw. FK506 wurden diese zun\u00e4chst mit dem entsprechenden Immunophilin-POD-Konjugat gemischt und anschlie\u00dfend auf die Sensoroberfl\u00e4che gegeben, wodurch sich der tern\u00e4re Komplex ausbildete. Das Verh\u00e4ltnis aus Maximalstrom zu Blindwert lag bei CsA bei einem Faktor von ca. 5 und bei FK506 sogar bei einem Faktor von ca. 15. Von CsA und FK506 konnten mit Hilfe des elektro-chemischen Transplantations-Biochips sehr erfolgreich Kalibrierkurven aufgenommen werden. Die Probenvorbereitung f\u00fcr alle Immunsuppressiva sowie der jeweiligen Metabolite ist erarbeitet worden. Die HPLC-MS Methoden zur Bestimmung der Immunsuppressiva CsA, Tacrolimus und Rapamycin wurden sehr erfolgreich optimiert; ein Vergleich mit etablierten Verfahren ergab gute bis sehr gute \u00dcbereinstimmung. Da die Rezeptorassays des Transplantations-Biochips auch immunsuppressiv wirkende Metaboli-te der Immunsuppressiva mit erfassen, wurden HPLC-MS-Methoden zur Detektion und Quantifizierung dieser <\/p>\n
Verbindungen ebenfalls erfolgreich entwickelt.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
\u00b7\tTeilergebnisse wurden in der DBU-Sonderpublikation mit dem Biotechnologie Nachrichten-Magazin transkript zur Biotechnica 2003 publiziert.
\n\u00b7\tDas Projekt wurde im Rahmen der Ausstellung Faszination Biotechnologie vorgestellt.
\n\u00b7\tEin Paper mit dem Titel Determination of CsA-equivalence values by a receptor assay based on surface plasmon resonance: A correlation to clinical parameters wurde beim International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics eingereicht.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die rekombinanten Fusionsproteine aus Immunophilin und Streptavidin mit nachfolgender Kopplung der biotinylierten Peroxidase zum fertigen Immunophilin-Enzym-Konjugat wurden erfolgreich hergestellt. Mit der Biacore-Methode konnte gezeigt werden, dass sich die beiden Immunophilin-Enzym \/ Immunsuppressivum \/ Calcineurin-Wirkkomplexe auf einer Sensoroberfl\u00e4che ausbilden; die angekoppelten Proteine beeintr\u00e4chtigen somit nicht die Ausbildung des in-vivo Wirkkomplexes. Die Immunsuppressiva CsA und Tacrolimus konnten anschlie\u00dfend sehr erfolgreich mit Hilfe des elektrochemischen Transplantations-Biochips unter Einsatz der Immunophilin-Enzym-Konjugate nachgewiesen werden. Parallel dazu wurde der elektrochemische Biochip basierend auf der Microfilling Technik zum Nachweis eines Analyten erfolgreich optimiert. Da im Vollblut die Immunsuppressiva an Membranen und Proteinen gebunden vorliegen, ist eine Extraktionsmethode, die ohne L\u00f6sungsmittel auskommt, erarbeitet worden, wodurch Extrakte direkt mit dem Transplantations-Biochip vermessen werden k\u00f6nnen. Die HPLC-MS-Methoden zur Bestimmung der Immunsuppressiva CsA, Tacrolimus und Rapamycin sowie derer Metabolite wurden sehr erfolgreich optimiert und etabliert. Diese HPLC-MS-Methoden erm\u00f6glichen nun eine umfassende Validierung des Transplantations-Biochips.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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