Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Chemische Modifikationen der DNA (DNA-Addukte) spielen bei der Entstehung chronischer Erkrankungen wie Krebs oder Alzheimer eine gro\u00dfe Rolle, die zur Zeit allerdings nicht genau verstanden wird. Dies ist unter anderem darin begr\u00fcndet, dass es bisher keine evaluierte analytische Methode gibt, die es erlaubt, alle DNA-Addukte, ob exogenen oder endogenen Ursprungs, mit hoher Empfindlichkeit gleichzeitig nachzuweisen. Ziel dieses Projektes ist es, das bisher verwendete radioaktive 32P-postlabeling-Verfahren zum Nachweis von DNA-Addukten durch ein nicht-radioaktives, hochempfindliches Verfahren f\u00fcr ein breiteres Substanzspektrum an DNA-Addukten zu ersetzen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenEs soll eine analytische Methode entwickelt werden, die den Nachweis von DNA-Addukten mittels Kapillarelektrophorese und Laserinduzierter Fluoreszenz-Detektion erm\u00f6glicht. Dazu werden Verfahren entwickelt, leistungsf\u00e4hige Fluoreszenzmarker an die durch enzymatischen Verdau adduktierter DNA erhal-tenen Nukleosid-3-Phosphate in hoher Ausbeute zu koppeln. Dies soll mittels der f\u00fcr die Oligonukleotid-synthese entwickelten Phosphoramidit-Technik erfolgen. Desweiteren sollen einige typische Repr\u00e4sentanten der wichtigsten DNA-Addukt-Klassen (polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, aromatische Amine, Alkylantien, reaktive Sauerstoff-Spezies) als interne Standards synthetisiert und auf die gleiche Weise fluoreszenzmarkiert werden. Die dabei zum Einsatz kommende Synthesestrategie geht von partiell gesch\u00fctzten Nukleosid-3-Phosphaten aus, die durch Umsetzung mit einem Fluoreszenzmarker am 5-OH-Ende der Desoxyribose markiert werden. Durch eine abschlie\u00dfende Entsch\u00fctzungsreaktion erh\u00e4lt man die gew\u00fcnschten Standardverbindungen. Die fluoreszenzmarkierten Produkte aus dem enzymati-schen Verdau adduktierter DNA werden dann kapillarelektrophoretisch aufgetrennt, durch Laserinduzierte Fluoreszenz detektiert, durch den Vergleich mit den internen Standardverbindungen identifiziert und quantifiziert.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Mit der entwickelten Methode gelang der Nachweis von 5-Methyl-2\u00b4-desoxycytidin-3\u00b4-monophosphat (5-Me-dCMP), das eine bedeutende Rolle in der Zelldifferenzierung und Genexpressionskontrolle besitzt und somit wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei vielen Krebserkrankungen spielt, sowohl in modifizierten Oligonukleotiden, in Kalbsthymus-DNA als auch in humaner, unmodifizierter DNA. Des weiteren wurden 1,N6-Etheno-2\u00b4-desoxyadenosin-3\u00b4-monophosphat (etheno-dAMP) und 1,N2-Propano-2\u00b4-desoxyguanosin-3\u00b4-monophosphat (Hex-dGMP), zwei Biomarker ern\u00e4hrungsbedingter Modifikationen und 8-Hydroxy-2\u00b4-desoxyguanosin-3\u00b4-monophosphat (8-HO-dGMP) als Biomarker f\u00fcr oxidativen Stre\u00df analysiert. Ferner wurden noch DNA-Addukte synthetisiert, charakterisiert und nachgewiesen, die auf die kovalente Bindung von 7?,8?-Dihydroxy-9?,10?-epoxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyren mit dGMP (B[a]P-dGMP) basieren. Auch wurden DNA-Addukte der Aristolochias\u00e4ure (AA-dNMP) untersucht, die als Biomarker der Chinesischen-Heilkr\u00e4uter-Nephropathie fungieren k\u00f6nnen. Als weitere DNA-Sch\u00e4den konnten apurinic sites (AP site) nachgewiesen werden, die sowohl durch saure Hydrolyse von dGMP und von Oligonukleotiden als auch durch Zersetzung von 8-HO-dGMP gebildet wurden.
\nZur qualitativen Bestimmung der unmodifizierten und modifizierten fluoreszenzmarkierten Nukleotiden wurden die Migrationszeiten der Analyten mit der Migrationszeit von dAMP normiert. Dies f\u00fchrte zu einer puffer- und kapillarchargenunabh\u00e4ngigen Reproduzierbarkeit der Migrationszeiten mit Standardabweichungen < 3 %. Zur quantitativen Bestimmung der Nukleotide mu\u00dften Quantenfaktoren aufgrund der starken Fluores-zenzl\u00f6schung durch dGMP bestimmt werden. Da diese Messungen nicht f\u00fcr alle DNA-Addukte durchf\u00fchrbar sind, wurde vorgeschlagen, zuk\u00fcnftig die Peakfl\u00e4chen aller \u00fcbrigen DNA-Addukte mit dem Quantenfaktor des jeweiligen unmodifizierten Nukleotids zu korrigieren. \nDie Reproduzierbarkeit der DNA-Hydrolyse, der Fluoreszenzderivatisierung und der kapillarelektrophoretischen Trennung wurde anhand von aliquotierten Kalbsthymus-DNA-Proben demonstriert. Mit Fluores-cein als internem Standard konnte eine Standardabweichung der Peakfl\u00e4chen zwischen 5,6 und 8,4 % (n = 29) erzielt werden. F\u00fcr eine exakte Quantifizierung mu\u00dften Derivatisierungsfaktoren f\u00fcr die unmodifizierten Nukleotide und 5-Me-dCMP aus mehreren Oligonukleotiden unterschiedlicher Sequenz bestimmt werden, die die nicht quantitativ verlaufende DNA-Hydrolyse und Fluoreszenzderivatisierung ber\u00fccksichtigen. So wurden korrigierte Peakfl\u00e4chen f\u00fcr jeweils 1 % dAMP (0,070), dGMP (0,038), dTMP (0,062), dCMP (0,042) und 5-Me-dCMP (0,046) mit relativen Standardabweichungen < 18 % bestimmt. Mit diesen Faktoren konnte nachgewiesen werden, da\u00df beispielsweise 2,95 \u00b1 0,18 % (RSD = 6,1 %; n = 7) aller Cytosine in der Kalbsthymus-DNA methyliert vorliegen, w\u00e4hrend die Konzentration von 5-Me-dCMP in den Leukocyten von an Leuk\u00e4mie erkrankten Personen (1,49 \u00b1 0,09 %, 2 Patienten, n = 10) und in humanen Melanomzelllinien (0,89 \u00b1 0,08 %, n = 5) auf eine Hypomethylierung hinweisen.\nDie Nachweisgrenze des Analysensystems liegt bei 6 pM f\u00fcr dAMP, dTMP und dCMP. Durch die Fluoreszenzl\u00f6schung verschlechtert sich die Nachweisgrenze des dGMP um Faktor 2. Aufgrund der nicht quantitativ verlaufenden DNA-Hydrolyse und Fluoreszenzmarkierung betr\u00e4gt die effektive Nachweisgren-ze 8,5 bzw. 17 pM. Mit einem Anreicherungsschritt in der Kapillare (electrostacking with reversed field) konnte die Nachweisgrenze auf 500 fM verbessert werden. Durch den milliardenfachen \u00dcberschuss an unmodifizierten Nukleotiden und der hohen Salzkonzentration in der Probe muss diese vor der Injektion allerdings 100-fach mit Wasser verd\u00fcnnt werden, um eine ausreichend hohe Effizienz gew\u00e4hrleisten zu k\u00f6nnen. Somit verschlechtert sich die Nachweisgrenze um Faktor 100, was ungef\u00e4hr einem Adduktlevel von 2,1 auf 106 unmodifizierten Nukleotiden entspricht (bzw. 1,4 auf 107 mit electrostacking with rever-sed field).\n\n\n\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation\n\nC.C.T. W\u00f6rth, Vortrag, 9th Frederick Conference on Capillary Electrophoresis, Frederick, Oktober 1999 \nSynthesis of fluorescently labeled alkylated DNA adduct standards and separation by capillary electrophoresis\nC.C.T. W\u00f6rth, O. J. Schmitz, C. Kliem und M. Wie\u00dfler, Poster, 10th AEK-Symposium, Heidelberg, M\u00e4rz 1999\nDNA Analysis by Capillary Electrophoresis and Laser-Induced Fluorescence Detection \nO. J. Schmitz, Vortrag, 4th National Postlabeling-Workshop, Wuppertal, Oktober 1999\nPostlabeling und Kapillarelektrophorese\nO. J. Schmitz, Vortrag, International Workshop of Food Preparation Methods and Cancer Risk, Heidelberg, November 1999\nDevelopment of a fluorescence-based method to determine DNA-adducts by capillary electropho-resis\nO. J. Schmitz, Vortrag, 13th HPLC-Symposium, Saarbr\u00fccken, Februar 2000\nAnalysis of Fluorescent labeled DNA-Adducts by Micellar Electrokinetic Chromatography\nO. J. Schmitz, Vortrag, 3th APCE-Symposium, Hong Kong, June 2000\nAnalysis of Fluorescent labeled DNA-Adducts by Micellar Electrokinetic Chromatography\nO. J. Schmitz, Vortrag, Institut f\u00fcr biologische Forschung (INBIFO GmbH), K\u00f6ln, August 2000\nEntwicklung eines Genotoxizit\u00e4tstests basierend auf der Analyse von fluoreszenzmakierten DNA-Addukten \nO. J. Schmitz, Vortrag, Schering AG, Berlin, Oktober 2000 \nEntwicklung eines automatisierbaren Genotoxizit\u00e4tstests durch Analyse fluoreszenzmarkierter DNA-Addukte\nD. Stach, C.C.T. W\u00f6rth, M. Wie\u00dfler, O. J. Schmitz, Poster, 14th HPCE-Symposium, Boston, Januar 2001\nMeasurement of Biomarkers in Chemical Carcinogenesis by CE-LIF\nO. J. Schmitz, Vortrag, Institut f\u00fcr angewandte Laserphysik (Universit\u00e4t Bielefeld), M\u00e4rz 2001\nAnalyse von Biomarkern der chemischen Kanzerogenese mit CE-LIF \nO. J. Schmitz, Vortrag, Fakult\u00e4t f\u00fcr Pharmazie (Universit\u00e4t Heidelberg), Juli 2001\nEntwicklung einer Methode zur Analyse von DNA-Addukten mittels Kapillarelektrophorese\nM. Wie\u00dfler, O. J. Schmitz, C.C.T. W\u00f6rth, \nDeutsche Patentanmeldung Verfahren zum Bestimmen von Nukleins\u00e4ure-Modifikationen 100 02 402.5\nM. Wie\u00dfler, O. J. Schmitz, C.C.T. W\u00f6rth, \nInternationale Patentanmeldung Verfahren zum Bestimmen von Nukleins\u00e4ure-Modifikationen PCT\/DE01\/00257\nC. C. T. W\u00f6rth, O. J. Schmitz, H.-C. Kliem, M. Wie\u00dfler, Electrophoresis 21 (2000) 2086-2091\nSynthesis of fluorescently labeled alkylated DNA adduct standards and separation by capillary electrophoresis\nO. J. Schmitz, C.C.T. W\u00f6rth, D. Stach, M. Wie\u00dfler, nalytical Chemistry (eingereicht)\nDNA adducts as biomarkers for carcinogenesis analyzed by capillary electrophoresis\n\n\nFazit\n\nEin entscheidender Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass DNA-Addukte, hervorgerufen durch unterschiedliche Klassen von Kanzerogenen, im Gegensatz zur klassischen 32P-Postlabeling-Methode, simul-tan nachgewiesen werden k\u00f6nnen. Verbunden mit der Automatisierbarkeit der entwickelten Derivatvisie-rungstechnik, der gesundheitlich unbedenklichen Durchf\u00fchrung und der kapillarelektrophoretischen Trennung erm\u00f6glicht das erarbeitete Konzept einen hohen Probendurchsatz und ist so zum Beispiel hervorragend f\u00fcr die Konzentrationsbestimmung von 5-Me-dCMP geeignet.\n<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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