Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Cryptosporidien und Giardien sind humanpathogene Parasiten, die \u00fcber menschliche und tierische F\u00e4kalien incl. Kl\u00e4ranlagenabl\u00e4ufe in die Umwelt gelangen. Insbesondere in Gew\u00e4ssern, die zur Trinkwassergewinnung oder als Badegew\u00e4sser dienen, k\u00f6nnen sie als belebte Schadstoffe f\u00fcr die menschliche Gesundheit betrachtet werden. Der Nachweis der Parasiten im Wasser ist schwierig und wird z. Zt. routinem\u00e4\u00dfig mit dem Mikroskop durchgef\u00fchrt. Diese Methode ist zeitaufwendig, von subjektiven Kriterien abh\u00e4ngig und kann zu Fehldiagnosen f\u00fchren. Ziel des Vorhabens ist es, bereits vorhandene und z. T. patentierte Nachweisverfahren auf der Basis molekularbiologischer Methoden durch Kombination mit anderen Techniken anwendungsreif zu machen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIn der ersten Phase des Projekts werden die bereits etablierten Verfahren a) Verdau freier DNA + In-vitro-Exzystierung + DNA-Extraktion + PCR f\u00fcr Cryptosporidien (kurz IVE-PCR) und b) das Verfahren der Multiplex-PCR f\u00fcr Cryptosporidien und Giardien optimiert. Der Kooperationspartner 4base Lab konstruiert f\u00fcr geeignete Primerpaare interne Kontrollen. Das TaqMan PCR Verfahren wird etabliert und seine Eignung f\u00fcr die genannten Methoden evaluiert. Die PCR-Verfahren werden anschlie\u00dfend mit den bereits bekannten Anreicherungstechniken IMS (Immunomagnetische Separation, Kooperationspartner DYNAL) und FACS (Fluorescence Activated Cell Sor-ting, Kooperationspartner Strathclyde Water Services) kombiniert. Die Effektivit\u00e4t und Reproduzierbarkeit der Verfahren wird in einer zweiten Phase im Rahmen von Ringversuchen mit den Kooperationspartnern (SPDL, Strathclyde WS, 4base Lab) getestet. Die PCR-Produkte verschiedener Cryptosporidien-Isolate werden bei 4base Lab sequenziert, um festzustellen, ob die Variabilit\u00e4t innerhalb der PCR-Zielsequenz (Template) so gro\u00df ist, da\u00df eine Unterscheidung von verschiedenen St\u00e4mmen m\u00f6glich wird. Dies w\u00e4re f\u00fcr epidemiologische Fragestellungen (Zusammenhang zwischen Umweltisolaten und Patientenisolaten) von go\u00dfem praktischem Nutzen und w\u00fcrde einen weiteren entscheidenden Vorteil der genannten molekularbiologischen Nachweismethoden darstellen. In einer dritten Projektphase werden die entwickelten Methoden in Feldversuchen eingestetzt. Bei nachgewiesener Eignung der Verfahren erfolgt eine Publikation der Methoden sowie ggf. eine Lizenzvermarktung f\u00fcr die patentierten Teile<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Durch Vergleich von 9 verschiedenen Cryptosporidien-Primerpaaren, 5 verschiedenen Giardienprimerpaaren und 4 verschiedenen Kombinationen f\u00fcr die Multiplex-PCR konnten die jeweils optimalen Primer mit einer Sensitivit\u00e4t von 1-10 Oozysten bzw. Zysten ermittelt werden. F\u00fcr den Cryptosporidien-Nachweis wurde ein TaqMan-PCR-Protokoll mit Interner Kontrolle entwickelt. F\u00fcr die Interne Kontrolle wurde die Bindungsstelle der TaqMan-Sonde entfernt und durch ein um 40 Basen l\u00e4ngeres Insert aus dem humanen Insulingen ersetzt. Um die Interne Kontrolle vom Original unterscheiden zu k\u00f6nnen, wurde eine zweite TaqMan-Sonde konstruiert, die nur an das Insert binden kann. Durch die unterschiedliche L\u00e4nge von Original und Interner Kontrolle k\u00f6nnen beide PCR-Produkte aber auch auf einem konventionellen Agarosegel gut unterschieden werden. Zus\u00e4tzlich wurden die PCR-Protokolle f\u00fcr den Giardien-Nachweis und den Cryptosporidien-Nachweis an eine Anwendung im LightCycler\u0099 adaptiert. Die Light-Cycler-PCR ist die derzeit modernste Form der PCR, bei der ein \u00e4hnliches Nachweisprinzip wie bei der TaqMan-PCR zum Tragen kommt, gleichzeitig aber die Analysenzeit durch eine Amplifikation in Glaska-pillaren drastisch verk\u00fcrzt wird. Auch die in vitro Exzystierung wurde f\u00fcr den anschlie\u00dfenden PCR-Nachweis methodisch optimiert. Die im Hinblick auf eine Multiplex-PCR getesteten Primer-Paare hatten f\u00fcr sich genommen zwar eine zufriedenstellende Sensitivit\u00e4t, bei ungleichem Mengenverh\u00e4ltnis von Cryptosporidien und Giardien im Probenmaterial traten jedoch Interferenzen zwischen den beiden Einzelreaktionen auf, die zur Unterdr\u00fcckung einer der beiden Reaktionen f\u00fchrten. Die Methode des Fluorescence Activated Cell Sorting zur Isolierung der Zielorganismen war ebenfalls unbefriedigend, da sie im Gegensatz zur Immunomagnetischen Separation in der Praxis keine Alternative zur Saccharoseflota-tion darstellte. Feldversuche und Ringversuche wurden daher ausschlie\u00dflich mit separaten PCR-Methoden und in Kombination mit der IMS durchgef\u00fchrt. Die Feldversuche an verschiedenen Oberfl\u00e4-chenw\u00e4ssern, Kl\u00e4ranlagenabl\u00e4ufen und Trinkw\u00e4ssern ergaben eine zufriedenstellende \u00dcbereinstimmung zwischen den PCR-Resultaten und den mikroskopisch ermittelten Vergleichswerten. Probleme ergaben sich z. T. bei der quantitativen PCR mit falsch positiven oder zu hohen Resultaten. An den Ringversuchen beteiligten sich das Hygiene-Institut T\u00fcbingen, 4 base lab und das SPDL. Die bei Strathclyde Wa-ter Services geplanten FACS-Analysen wurden aus den o. g. Gr\u00fcnden nicht durchgef\u00fchrt. Statt dessen wurde die Analysenzahl mit IMS verdoppelt. Das Ringversuchsprotokoll wurde in Anlehnung an Ringver-suchsvorschriften gestaltet, die vom britischen Drinking Water Inspectorate Mitte 1999 herausgegeben wurden. Demzufolge wurde als Probenmatrix jeweils 100 Liter hartes und weiches Trinkwasser verwen-det. Jedes der drei Laboratorien hatte insgesamt 72 Einzelanalysen durchzuf\u00fchren: 36 aus hartem Wasser und 36 aus weichem Wasser. Jeweils 12 mit IMS gereinigte Proben wurden mikroskopisch, sowie mit konventioneller nested-PCR (hartes Wasser nur in 2 Laboratorien) und mit quantitativer LightCycler-PCR untersucht. Es wurden Konzentrationen von 0, 10 und 100 Oozysten pro Ansatz eingesetzt. Dabei stellte sich eindeutig heraus, dass die IMS in weichem Wasser besser funktionierte als in hartem Wasser. Auf die PCR-Ergebnisse hatte die Wasserh\u00e4rte jedoch keinen offensichtlichen Einfluss. Bei der qualitativen nested PCR ergab sich lediglich ein falsch positives und ein eindeutig falsch negatives Ergebnis. Weitere 7 negative Resultate ergaben sich bei Konzentrationen, die mikroskopisch ebenfalls negativ wa-ren oder sehr niedrige Oozystenzahlen enthielten (1, 2, 2 bzw. 10 Oozysten). Die LightCycler-Ergebnisse waren f\u00fcr eine quantitative PCR in diesen niedrigen Konzentrationsbereichen erstaunlich pr\u00e4zise. Auch hier gab es jedoch vereinzelt falsch positive und falsch negative Resultate. Bei 100 eingesetzten Oozysten pro 100 Liter trat jedoch nur ein einziges falsch negatives Resultat auf.
\nDie Versuche zur Sequenzierung von PCR-Produkten ergaben, dass sowohl bei Cryptosporidien als auch bei Giardien Sequenzunterschiede auftreten, die eine Unterscheidung von mindestens zwei bis drei Genotypen zul\u00e4sst.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Status-Kolloquium in T\u00fcbingen; Vortr\u00e4ge: OECD Interlaken, DGHM Berlin, DGHM Regensburg, DGP Hohenheim; Poster: DGHM Regensburg, DGHM M\u00fcnchen, IAW 2000 Paris; Zeitschriften-Beitrag: Re-view in J. Indust. Microbiol. Biotechnol.; Buchbeitrag: in Rapid Cycle Real Time PCR – Methods and Applications, Springer Verlag; Internet: Kurzfassung der Vortr\u00e4ge des Statuskolloquiums (Online Publikations-Server der Uni T\u00fcbingen), DBU-Zwischenbericht (Homepage des Hygiene-Instituts), Beitrag zu Molecular Technologies for Safe Drinking Water (Homepage der EAWAG, Schweiz).<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Als alternative Methode zum mikroskopischen Nachweis erscheint die LightCycler-PCR in Kombination mit der IMS in verschiedener Hinsicht am geeignetsten: kurze Analysezeit, quantitatives Ergebnis, gerin-ge Kontaminationsgefahr bei ausschlie\u00dflicher Anwendung. Diese Methode bleibt daher am Hygiene-Institut dauerhaft etabliert und wird auch bei 4 base lab weiterhin angeboten. Es bestehen hier auch weitere Optimierungsm\u00f6glichkeiten: z. B. durch die Konstruktion von exakt definierten und lange haltba-ren synthetischen Standards, die die Referenz-Oozsten ersetzten k\u00f6nnen, die derzeit noch im Tier produziert werden m\u00fcssen und derzeit sowohl f\u00fcr die mikroskopische als auch f\u00fcr die PCR-Methode not-wendig sind.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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