Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Im Rahmen des Projektes soll ein Test etabliert und zur Marktreife gebracht werden, mit Hilfe dessen sich die individuelle Tabakexposition empfindlich, exakt, schnell und ohne apparativen Aufwand erfassen l\u00e4sst. Eingesetzt werden soll dieser Test unter anderem bei Personen, die willens sind, sich einem Rauchentw\u00f6hnungsprogramm zu unterziehen, sowie f\u00fcr versicherungstechnische Fragestellungen. Insbesondere f\u00fcr die Kontrolle von Schwangeren sowie jungen Eltern ist dieses Testsystem von Relevanz, da allein bis zu zwei Drittel aller F\u00e4lle von pl\u00f6tzlichem Kindstod auf elterliches Rauchen zur\u00fcckzuf\u00fchren sind.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden\u00b7\tSynthese eines Cotinin-Konjugates;
\n\u00b7\tEntwicklung und Optimierung eines Assay zum quantitativen Nachweis von Cotinin unter Verwendung des bei der Firma BioTrend k\u00e4uflichen anti-Cotinin-Antiserums vom Schaf;
\n\u00b7\tEntwicklung und Testung eines eigenen polyklonalen anti-Cotinin-Antiserums in Kaninchen und Aufbereitung von affinit\u00e4tsgereinigten Antik\u00f6rpern daraus;
\n\u00b7\tWeiterentwicklung des o.g Cotinin-Assay unter Verwendung dieses polyklonalen Antik\u00f6rpers;
\n\u00b7\tEntwicklung und Testung eines eigenen monoklonalen anti-Cotinin-Antik\u00f6rpers;
\n\u00b7\tWeiterentwicklung des o.g. Cotinin-Assay unter Verwendung des eigenen monoklonalen Antik\u00f6rpers;
\n\u00b7\tAuswahl der optimalen Assay-Variante nach Sensitivit\u00e4t, Spezifit\u00e4t, Pr\u00e4zision, Wiederfindungsraten, Matrix-Effekten etc.;
\n\u00b7\tValidierung des Assay zun\u00e4chst gegen\u00fcber einem Fragebogen zur Tabakexposition;
\n\u00b7\tValidierung des Assay f\u00fcr Urin und Mekonium durch Vergleich mit konventioneller aufwendiger HPLC-Methode.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
\u00b7\tIn der ersten Version des Abicap\u00ae-Cotinin-Assay wurden die Mekonium- und Urinproben mit unbekannter Cotinin-Konzentration mit einer definierten Menge BSA-Cotinin-Biotin-Konjugat vorinkubiert, um beide dann miteinander um die Bindung an den affinit\u00e4tsgereinigten anti-Cotinin-Antik\u00f6rper aus dem Antiserum der Fa. BioTrend konkurrieren zu lassen. Das Gemisch der so entstandenen Komplexe wurde in einer zuvor mit Anti-Schaf-IgG-Antik\u00f6rper beschichtete Abicap\u00ae-S\u00e4ule zur\u00fcckgehalten. Abicap\u00ae Red wurde zugegeben und der durch BSA-Cotinin-Biotin-Konjugat induzierte Farbumschlag im Abicap\u00ae Reader quantifiziert. Damit korrelierte die Farbreaktion mit dem gebundenen BSA-Cotinin-Biotin-Konjugat-Komplex und war entsprechend indirekt proportional zur Cotininmenge der Probe. Eine Quantifizierung war durch Vergleich mit Standards m\u00f6glich. Dieses Testprotokoll wurde sukzessive bzgl. der verschiedenen Konzentrationen und Inkubationszeiten opti-miert.
\n\u00b7\tZur Produktion polyklonaler Antik\u00f6rper wurde Kaninchen ein H\u00e4mocyanin-Cotinin-Konjugat mehrfach verabreicht. Aus dem Serum der Tiere lie\u00dfen sich ausreichende Antik\u00f6rpermengen isolieren. Die Affinit\u00e4t der so gewonnenen Antik\u00f6rper war nicht h\u00f6her als die des kommerziell erh\u00e4ltlichen Antik\u00f6rpers. Daher wurden das Ziel der Produktion eines eigenen polyklonalen Antik\u00f6rpers nicht weiter verfolgt.
\n\u00b7\tDie Produktion eines eigenen monoklonalen anti-Cotinin-Antik\u00f6rpers bzgl. Antik\u00f6rper-Konzentration und -Menge wurde in mehreren Schritten durch Immunisierung von jeweils 5 M\u00e4usen mit verschiedenen Cotinin-Konjugaten optimiert. Letztendlich lie\u00df sich bei einer Konzentration von 100 ng\/ml eine ca. 75%ige Inhibition erzielen.
\n\u00b7\tIn einer weiteren Version des Abicap\u00ae-Cotinin-Assay wurde daher die Fritte nicht mit Anti-Schaf-IgG-Antik\u00f6rper, sondern mit einem Schaf-Antik\u00f6rper gegen Maus-IgG beschichtet, und die Vorinku-bation erfolgte mit dem eigenen monoklonalen anti-Cotinin-Antik\u00f6rper. Ansonsten waren, wie umfangreiche Erprobungen ergaben, \u00c4nderungen des Testprotokolls nicht notwendig.
\n\u00b7\tLetztendlich fiel u.a. wegen des Preisvorteils die Entscheidung f\u00fcr diese letztgenannte Testvariante. Die untere Detektionsgrenze liegt im Bereich von 200 ng\/ml, die obere bei ca. 12800 ng\/ml. Urinpro-ben von Rauchern- und Nichtrauchern k\u00f6nnen damit ebenso wie die von starken und m\u00e4\u00dfigen Rauchern unterschieden werden. F\u00fcr die Diskriminierung von Nicht- und Passivrauchern reicht die Empfindlichkeit des Tests nicht aus. Unerwartete Schwierigkeiten, die als Matrix-Effekte identifiziert werden konnten, traten bei der Anwendung an Mekoniumproben auf. Der Test ist f\u00fcr Mekoniumproben von intrauterin tabakexponierten Neugeborenen nicht geeignet. Hier bietet das herk\u00f6mmliche Ver-fahren, die HPLC-Methode Vorteile. Zusammenfassend erwiesen sich die vorgesehenen Arbeiten in einem wesentlichen Teil als prinzipiell durchf\u00fchrbar und wurden fristgerecht abgeschlossen.
\n\u00b7\tNach der Einsicht, dass der Test f\u00fcr Mekoniumproben ungeeignet ist, wurden im Laufe des Projektes zus\u00e4tzliche Aktivit\u00e4ten auf die Durchf\u00fchrung einer gr\u00f6\u00dferen Studie zur Rauchentw\u00f6hnung konzentriert, die noch andauert. Hierzu wird eine Wiederholung der Probensammlung nach ca. 3 Monaten zur \u00dcberpr\u00fcfung des Erfolgs einer Empfehlung zur Beendigung des Rauchens durchgef\u00fchrt.
\n\u00b7\tBei der Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern traten keine Probleme auf.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Die Ergebnisse scheinen zur Publikation sowohl in einer wissenschaftlichen Zeitschrift als auch in der Laienpresse geeignet.
\nEs ist vorgesehen, den Abicap\u00ae-Cotinin-Assay kommerziell verf\u00fcgbar zu machen und so \u00c4rzten, Apothekern und Laien ein schnelles, kosteng\u00fcnstiges und dennoch pr\u00e4zises Werkzeug f\u00fcr Urinproben zur Quantifizierung der individuellen Tabakexposition bereitzustellen. Dieses Werkzeug soll unterst\u00fctzend in der Reduktion des Tabakkonsums und dessen Folgen eingesetzt werden. Anwendungsgebiete sollen der Einsatz in Rauchentw\u00f6hnungsprogrammen, insbesondere bei jungen M\u00fcttern, sowie bei arbeitsmedizinischen (MAK-Konzentrationen) und versicherungstechnischen (Nichtraucherbonus im Versicherungsbeitrag) Fragestellungen sein.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die vorgestellte Methode hat sich bei der Anwendung an Urinproben als effiziente Alternative zu den herk\u00f6mmlichen, umweltbelastenden und kostenaufwendigen Analyseverfahren bew\u00e4hrt und kann somit in einem n\u00e4chsten Schritt unbedenklich einem breiten Anwenderfeld zug\u00e4nglich gemacht werden.
\nF\u00fcr Mekoniumproben bestehen keine Vorteile gegen\u00fcber der HPLC-Methode.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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